Электрофорез продуктов ПЦР в денатурирующем градиентном геле

Электрофорез продуктов ПЦР в денатурирующем градиентном геле, * электрафарэз прадуктаў ПЛР у дэнатурыруючым градыентным гелі * denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-products or DGGE of PCR-p. — электрофорез нуклеотидов, в основе которого лежат особенности плавления двухцепочечных фрагментов ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов. Эти особенности определяют условия плавления этих фрагментов в денатурирующих условиях. Отсюда следует, что мутации (в том числе и одиночные замены нуклеотидов) могут изменять температуру плавления (денатурации) локальных участков ДНК. Участки ДНК в зависимости от последовательности нуклеотидов в условиях постоянной температуры будут плавиться при определенных концентрациях денатурирующего агента. В результате положение фрагментов в геле по завершении электрофореза будет зависеть от событий их плавления и, в конечном счете, от нуклеотидной последовательности. Наличие мутации увеличивает или понижает температуру плавления соответствующего участка. Следовательно, фрагмент ДНК, содержащий мутацию, плавится при более низкой (или более высокой) концентрации денатурирующего агента в геле и двигается медленнее (или быстрее) при электрофорезе по сравнению с аналогичным фрагментом ДНК дикого типа. С появлением метода ПЦР получение фрагментов ДНК определенной длины, полностью идентичных анализируемому участву ДНК, стало простой задачей. Для повышения разрешающей способности электрофореза в денатурирующем градиентом геле один из праймеров при проведении ПЦР выбирают т. обр., чтобы его ГЦ-состав был максимально возможным. Это предотвращает преждевременную полную денатурацию и расхождение цепей продуктов ПЦР во время электрофореза, поскольку противоположные цепи денатурирующих фрагментов ДНК будут более продолжительное время связаны друг с другом ГЦ-богатыми последовательностями праймеров. Полагают, что метод электрофоретического разделения фрагментов ДНК в гелях с градиентом денатурирующих агентов позволяет обнаруживать до 95% мутаций. Однако, несмотря на высокую эффективность, этот метод не позволяет точно локализовать мутации в анализируемых участках ДНК.